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本制品利用聚丙烯酰胺凝胶电泳原理，采用合理设计的预混合配方和配制流程，可在50分钟内配制得到高质量的聚丙烯酰胺凝胶，制备的分离胶浓度为6%，用于变性和非变性蛋白凝胶电泳。

• 方便：彩色上层胶，方便上样；上层胶和下层胶溶液1:1混合，无需计算。
  
• 安全：不用接触有毒粉末；不用单独添加TEMED。
  
• 兼容性广：制胶溶液中不含SDS，可用于非变性电泳（Native-PAGE）。

本试剂盒大约可以配制60～125块常规大小（8×10cm）PAGE凝胶，具体数量根据凝胶厚度决定：0.75mm厚度凝胶可以配制125块胶，1mm厚度凝胶可以配制至少90块胶，1.5mm厚度凝胶可以配制至少60块胶。

• 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
  
• 根据下表参考选择合适的凝胶浓度。
  表一：不同浓度的PAGE下层胶的最佳分离范围
  

  下层胶（分离胶）浓度	最佳分离范围
  6%	50～350kD
  8%	35～300kD
  10%	20～150kD
  12%	15～100kD
  15%	10～80kD

• 根据下表配制凝胶。
  表二：凝胶配制表
  

  下层胶配方				上层胶配方
  胶厚度	下层胶溶液B	下层胶溶液A	改良型促凝剂	胶厚度	彩色上层胶溶液B	上层胶溶液A	改良型促凝剂
  0.75mm	2mL	2mL	40μL	0.75mm	0.5mL	0.5mL	10μL
  1.0mm	2.5mL	2.5mL	50μL	1.0mm	0.75mL	0.75mL	15μL
  1.5mm	4mL	4mL	80μL	1.5mm	1mL	1mL	20μL

  • 取等体积下层胶溶液B和下层胶溶液A，各2.0/2.5/4.0mL，混匀；
    
  • 混合溶液中加入40/50/80μL的改良型促凝剂，轻轻混匀，将混匀后的溶液注入制胶玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5cm即可；
    
    • 此溶液为过量，请勿全部注入。
  • 沿玻璃板缓慢加入适量灭菌水或无水乙醇覆盖于下层胶之上，待下层胶凝固后，倒去上层水或乙醇；
    
    • 当水（乙醇）和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固；25℃时5～10分钟可以聚合。
  • 取等体积彩色上层胶溶液B和上层胶溶液A，各0.5/0.75/1.0mL，混匀；
    
  • 向混合溶液中加入10/15/20μL的改良型促凝剂，轻轻混匀，插入梳齿；
    
  • 待上层胶凝固后（约20～40min），拔去梳齿即可用于电泳。
    
    • 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。上层胶25℃ 20～25分钟可以聚合；18℃ 35～40分钟可以聚合。

• SDS-PAGE变性电泳：
  
  • 电泳缓冲液配制：将5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液干粉（自备，组份0.96M甘氨酸，0.125M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L烧杯中，加入约900mL水彻底溶解，用水定容至1L，即配成5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（此溶液不用调节pH值）。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。
    
  • 样品处理：融化-混合-变性-上样
    5×MonoColor蛋白上样缓冲液常温数分钟解冻后轻轻摇匀，以确保溶液混合均匀；将缓冲液与蛋白样品按照1∶4的比例混匀，如8μL样品加入2μL 5×上样缓冲液；将蛋白样品置于95℃中加热5～10分钟；蛋白样品加入凝胶加样孔内电泳。
    
  • 电泳过程：在电泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，用1mL吸头彻底冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。
    表三：SDS-PAGE电泳条件
    

    恒电压	起始电流（一板胶）	结束电流（一板胶）	电泳时间	适用条件
    150V	35～40mA	15～20mA	55+ min	最佳电压，最优的分辨率
    200V	45～55mA	20～25mA	45+ min	节省时间
    225V	40～50mA	15～20mA	35+ min
    250V	65～75mA	20～25mA	30+ min
    300V	70～80mA	25～35mA	25+ min	最省时间

• 非变性电泳(Native-PAGE)：
  
  • 电泳缓冲液配制：将5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液干粉（自备，组份0.96M甘氨酸，0.125M Tris）全部倒入1L烧杯中，加入约900mL水彻底溶解，用水定容至1L，即配成5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（此溶液不用调节pH值）。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。
    
  • 样品处理：融化-混合-上样
    5×非变性非还原蛋白上样缓冲液常温数分钟解冻后轻轻摇匀，以确保溶液混合均匀；将缓冲液与蛋白样品按照1∶4的比例混匀，如8μL样品加入2μL 5×上样缓冲液；蛋白样品加入凝胶加样孔内电泳。注：非变性电泳样品不能加热处理。
    
  • 电泳过程：在电泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，用1mL吸头彻底冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
    表四：Native PAGE电泳条件
    

    	恒电压	起始电流	结束电流	电泳时间	适用条件
    推荐电压	150V	25-35/板胶	5-10mA/板胶	60+ min	最佳电压，最优的分辨率

• 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量QuickLan蛋白染色液或常规考马斯亮蓝染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），条带1～2分钟即可见。
  
• 摇床常温摇动10～15分钟至条带清晰可见。
  
• 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1～2次蒸馏水，摇床常温摇动10～15分钟至背景干净。
  
• 观察保存结果。